Inhibitory Effect of Usnic Acid on Proliferation of Human Bladder Cancer Cells
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摘要:
为了探究松萝酸对人膀胱癌的影响,体外培养人膀胱癌细胞T24、RT4,用不同浓度(12.5、25、50、100、200 μmol/L)的松萝酸分别处理T24、RT4细胞24 h和48 h,采用MTT法检测T24、RT4细胞的增殖情况。研究结果发现松萝酸处理后细胞内的活性氧(ROS)水平增加且通过线粒体途径、死亡受体途径来诱导T24细胞发生凋亡:(1)松萝酸对T24、RT4细胞增殖均有抑制作用,且均呈现时间和剂量依赖性,其中,松萝酸对T24细胞增殖的抑制率更高;(2)通过Hoechst 33342染色与Annexin V-FITC/PI双染发现,随着松萝酸浓度的升高,凋亡的T24细胞逐渐增多;(3)T24细胞经松萝酸处理后,细胞内ROS水平升高,cleaved-Caspase-3、cleaved-Caspase-8、cleaved-Caspase-9和Bax蛋白的表达量增加,Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9和Bcl-2蛋白的表达量降低,且Bax蛋白表达量与Bcl-2蛋白表达量的比值增加。
Abstract:In order to investigate the effect of usnic acid on human bladder cancer, cultured human bladder cancer cells T24 and RT4 were treated with different concentrations of usnic acid (12.5, 25, 50, 100, 200 μmol/L) for 24 h and 48 h, respectively, and the proliferation of T24 and RT4 cells was detected by MTT assay. The results showed that intracellular reactive oxygen species (ROS) levels were increased after treatment with usnic acid, and apoptosis of T24 cells was induced through mitochondrial pathway and death receptor pathway: (1)Usnic acid inhibited the proliferation of T24 and RT4 cells in a time-dependent and dose-dependent manner, and the inhibitory rate of usnic acid on T24 cell proliferation was higher. (2)By Hoechst 33342 staining and Annexin V-FITC/PI double staining, apoptotic T24 cells gradually increased with the increase of the concentration of usnic acid. (3)After treatment with usnic acid, the level of intracellular ROS increased, the expression of Bax, cleaved-Caspase-8, cleaved-Caspase-9 and cleaved-Caspase-3 protein increased, the expression of Bcl-2, Caspase-3, Caspase-8 and caspase-9 decreased, and the ratio of Bax protein expression to Bcl-2 protein expression increased.
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Keywords:
- usnic acid /
- bladder cancer /
- apoptosis /
- mitochondrial pathway /
- death receptor pathway
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膀胱癌(bladder cancer,BC)是泌尿系统最常见的恶性肿瘤之一。据世界卫生组织最新报道[1],全球膀胱癌每年新增病例约为74 000例,占所有新发肿瘤总数量的7%,其发病率和病死率在中国也呈逐年上升趋势。手术切除是治疗膀胱癌普遍采用的手段,但是患者术后极易复发[2]。目前临床常用的化疗药物对膀胱癌治疗效果不理想,存在毒性大、耐药性等缺点。
松萝酸(Usnic acid,UA)是一种二苯并呋喃衍生物,广泛分布于松萝(Usneaceae)、白松属(Alectoriaceae)和拉马利纳(Ramalinaceae)等地衣属的各种物种中[3]。松萝酸作为地衣代谢物,自1844年由克诺普(knop)首次分离得到以来,得到了广泛的研究,并且是为数不多的市售产品之一[4]。目前,松萝酸被用作膳食补充剂减轻体质量,但使用过量会引起肝脏毒性[5]。国内学者主要研究松萝酸的活性及其作用机理。如,左舒婷[6]发现松萝酸处理后,乳腺癌细胞内的ROS水平增加,并通过线粒体途径杀死乳腺癌细胞; 耿晓歌[7]发现松萝酸可通过调节周期相关蛋白诱导胃癌细胞周期阻滞、激活caspase级联反应和调节Bcl2家族蛋白诱导细胞凋亡,发挥抑制胃癌细胞BGC823和SGC7901增殖的作用。然而,松萝酸对膀胱癌的作用及机制研究未见报道。本研究以人膀胱癌细胞T24、RT4为研究对象,探讨松萝酸对人膀胱癌的抑制作用机理,以期为松萝酸作为抗癌药物的开发以及膀胱癌的治疗提供支撑。
1. 材料与方法
1.1 主要试剂和仪器
主要试剂:松萝酸,阿拉丁试剂有限公司;DMEM培养基,美国Gibco公司;MTT、DMSO、Bax、Caspase-3、GAPDH和HRP标记山羊抗兔IgG,生工生物工程上海股份有限公司;anti-Bcl-2,武汉博士德生物有限公司;cleaved-Caspase-8、cleaved-Caspase-9、cleaved-Caspase-3,Affinity Biosciences;Hoechst 33342染色液(C0031),BCA蛋白浓度测定试剂盒(PC0020),磷酸酶制剂(P260),Annexin Ⅴ-FITC/PI凋亡检测试剂盒(CA1020),北京索莱宝科技有限公司;5-氟尿嘧啶(5-FU),天津金耀氨基酸有限公司;PMSF(ST506),超敏ECL化学发光试剂盒(P0018S),碧云天生物技术公司;DCFH-DA,Sigma-Aldrich公司。
主要仪器:二氧化碳恒温培养箱,新加坡ESCO公司;酶标仪、PowerPacTM Basic电泳仪,美国BIO-RAD公司;SYGN2/7503化学发光凝胶成像系统,英国Gene公司;ECLIPSE Ts2倒置荧光显微镜,日本尼康公司;流式细胞仪,美国BD公司;VarioskanTM LUX多功能微孔板读数仪,美国Thermo Scientific公司。
1.2 细胞株及培养方法
人膀胱癌细胞T24、RT4从中国科学院大连化学物理研究所获得;2株细胞均培养在含有体积分数为10%的胎牛血清、质量浓度为100 g/L的链霉素、每毫升100个单位的青霉素的DMEM培养基内,于37 ℃、体积分数为5% 的CO2饱和湿度下传代培养,使细胞保持在对数生长期,用于后续实验。
1.3 MTT法对药物增殖抑制作用的测定
松萝酸溶于DMSO中,使母液的浓度为50 mmol/L(DMSO的终体积分数小于0.5%),除菌后-20 ℃保存。处理上述2株细胞,台盼蓝染色,利用血球计数板计数,选取存活率不低于95%的细胞进行实验。将细胞浓度调整为3×104个/mL,向96孔板接种处于生长对数期的细胞。培养12 h贴壁后吸出原培养基,用无血清的培养基稀释松萝酸母液,使其浓度分别为12.5、25、50、100、200 μmol/L,依次加入96孔板中; 阳性对照组中加入浓度为200 μmol/L的5-FU;空白对照组加入等量完全培养基。培养结束前4 h加入10 μL MTT溶液(5 g/L)。培养结束后,弃上清液,每孔加入200 μL DMSO,置于摇床上摇20 min;待甲臜充分溶解后,用酶标仪于490 nm处测定吸光度(A),计算抑制率,实验重复3次。抑制率的计算公式为:
抑制率 =(1−A实验组 /A对照组 )×100% 。 1.4 细胞形态学观察
不同浓度(100、200 μmol/L)的松萝酸与浓度为200 μmol/L的5-FU分别处理6 h后,加入适量的质量浓度为1 mg/mL的Hoechst 33342溶液,使其终质量浓度为2 μg/mL,避光染色10 min,用荧光显微镜观察细胞形态变化并拍照。
1.5 细胞凋亡检测
不同浓度(100、200 μmol/L)的松萝酸与浓度为200 μmol/L的5-FU分别处理24 h后收集细胞,将细胞重悬于200 μL的Binding Buffer中,加入10 μL的Annexin V-FITC和5 μL的PI,轻轻混匀,避光室温孵育15 min后,过孔径约为48 μm的细胞筛,用流式细胞仪(FACS Calibur;BD Biosciences)检测具体的细胞凋亡情况。
1.6 细胞活性氧(ROS)检测
不同浓度(100、200 μmol/L)的松萝酸与浓度为200 μmol/L的5-FU分别处理3 h后,弃去培养基,加入100 μL DCFH-DA溶液(终浓度为10 μmol/L) 孵育20 min,在激发波长为503 nm、发射波长为525 nm的条件下,用多功能酶标仪检测荧光强度。
1.7 Western Blot检测凋亡相关蛋白
不同浓度(100、200 μmol/L)的松萝酸处理6 h后,收集细胞。在4 ℃下,用细胞裂解缓冲液(RIPA、PMSF Protease Inhibitor、Phosphatase Inhibitors)提取细胞总蛋白40 min;以10 000 r/min离心10 min,收集上清液并用BCA蛋白质测定试剂盒检测蛋白质浓度。通过Western Blot法测定Caspase-3、cleaved-Caspase-3、Caspase-8、cleaved-Caspase-8、Caspase-9、cleaved-Caspase-9、Bax、Bcl-2、Bid和GAPDH的蛋白表达量。使用化学发光试剂ECL试剂盒和发光图像分析仪使目的蛋白可视化。通过Image J软件分析蛋白质表达灰度值,并通过GAPDH的值标准化。
1.8 统计学分析
实验数据以x±s表示,采用GraphPad Prism 7.04软件统计分析。采用双尾t检验和单因素方差比较组间差异,P < 0.05表示差异有统计学意义。
2. 结果
2.1 松萝酸对2株人膀胱癌细胞的增殖抑制作用
不同浓度(12.5、25、50、100、200 μmol/L)的松萝酸处理T24、RT4细胞24、48 h后,其细胞的抑制率(表 1)表明:与对照组相比,随着松萝酸浓度的增加,2株肿瘤细胞的抑制率均有不同程度下降且多数为极显著差异(P < 0.01);处理48 h后的细胞存活率低于处理24 h后的,表明松萝酸抑制肿瘤细胞增殖呈浓度和时间依赖性,且松萝酸对T24细胞的抑制效果更佳。因此,选取T24细胞作为后续机理研究的实验细胞。
表 1 松萝酸对2株肿瘤细胞的抑制率Table 1. The inhibitory rates of two human bladder cancer cell lines treated with usnic acid% 组别 24 h 48 h T24 RT4 T24 RT4 空白对照组 0 0 0 0 阳性对照组 14.90±0.45** 24.96±3.84** 23.89±3.53** 34.83±4.36** 12.5 μmol/L UA 3.60±1.23* 2.59±0.37 1.53±0.34 3.65±0.54 25 μmol/L UA 5.82±0.76* 4.78±1.34* 10.42±3.69* 5.93±1.03 50 μmol/L UA 13.16±3.82** 16.95±4.37* 24.37±2.65** 20.45±0.84* 100 μmol/L UA 42.93±0.98** 35.56±2.46** 48.35±3.43** 41.72±1.13** 200 μmol/L UA 58.39±1.57** 39.13±2.35** 62.32±1.44** 55.34±2.40** 注:与空白对照组相比,*表示P < 0.05,* *表示P < 0.01。 2.2 松萝酸诱导人膀胱癌细胞T24发生凋亡
以不同浓度(100、200 μmol/L)的松萝酸处理T24细胞6 h后,在光学显微镜下的观察结果(图 1A)表明:浓度为200 μmol/L的松萝酸处理后,明显看出细胞间接触消失、染色质固缩、细胞皱缩。由于细胞在凋亡时,膜通透性增强,使染料更容易进入细胞,在荧光显微镜下的观察结果(图 1B)表明:松萝酸加药组的荧光强度远高于空白对照组。
Hoechst 33342染色实验为凋亡的定性检测,再通过Annexin V-FITC和PI染色实验来进行定量分析。实验结果(图 1C)显示:不同浓度的松萝酸处理T24细胞24 h后,与阴性对照组相比,随着松萝酸浓度的增加,细胞的凋亡率越来越高(P < 0.01)。
综上结果表明松萝酸能够以量效的方式来引起T24细胞发生凋亡。
2.3 松萝酸对T24细胞内活性氧的影响
以不同浓度(100、200 μmol/L)的松萝酸处理T24细胞3 h后的实验结果(图 2)显示:与空白对照组相比,松萝酸能够以剂量依赖性使细胞内的ROS水平显著增加。结果表明松萝酸处理后T24细胞内ROS水平增加,从而导致T24细胞发生凋亡。
2.4 松萝酸对T24细胞蛋白表达的影响
松萝酸处理6 h后,用蛋白质印迹(Western Blot) 法检测细胞凋亡相关蛋白表达量的变化。结果(图 3,图 4)表明:与阴性对照组相比,松萝酸处理后的细胞内促凋亡蛋白Bax与逆凋亡蛋白Bcl-2表达量的比值显著增加;随着松萝酸浓度的增加,Caspase-8、Bid、Caspase-9、Caspase-3蛋白的表达量极显著下降,cleaved-Caspase-8、cleaved-Caspase-9、cleaved-Caspase-3蛋白的表达量显著升高。
3. 讨论
KUMAR等[8]研究发现松萝酸通过ROS的产生和DNA损伤诱导人胃腺癌AGS和胃癌SNU-1细胞凋亡;SINGH等[9]发现:对于肺癌细胞的抑制作用,松萝酸主要是通过引发肺癌细胞A549周期中G0 /G1期的阻滞来抑制细胞生长,并通过线粒体膜去极化来诱导肺癌细胞的凋亡;KOPARAL等[10]发现松萝酸不仅能抑制前列腺癌细胞及黑色素瘤细胞增长,还具有抑制肿瘤细胞迁移的能力。
本研究用不同浓度(12.5、25、50、100、200 μmol/L)的松萝酸处理人膀胱癌细胞T24、RT4,结果发现松萝酸抑制2株膀胱癌细胞增殖呈浓度和时间依赖性。通过Hoechst 33342染色与Annexin V-FITC/PI双染进一步确定松萝酸诱导T24细胞发生凋亡。最后采用Western Blot法检测凋亡相关蛋白的相对表达量。
诱导细胞发生凋亡有2条途径:线粒体途径和死亡受体途径。Bcl-2家族蛋白[11]在线粒体途径的调控中扮演着关键角色,包括抗凋亡蛋白(如Bcl-2)和促凋亡蛋白(如Bax),促凋亡蛋白与抗凋亡蛋白的比值升高时,线粒体内、外膜的通透性升高,使线粒体内的细胞色素C等促凋亡因子释放到细胞质中,细胞色素C与Apaf-1、Caspase-9前体形成凋亡复合体并活化Caspase-9,致使其酶原表达量下降[12]。死亡受体途径中,Caspase-8在死亡诱导信号复合物(Death Inducing Signaling Complex,DISC)形成过程中被活化,活化的Caspase-8通过切割促凋亡因子Bid使其活化成tBid,进而影响线粒体膜电位变化,最终与线粒体途径相互连接。Caspase-3作为细胞凋亡的“执行者”,正常情况下无活性,活化的Caspase-9和活化的Caspase-8均可切割并激活Caspase-3酶原,进而启动细胞凋亡[13]。与本研究结果一致,促凋亡蛋白Bax的表达量增高,抗凋亡蛋白Bcl-2的表达量下降,且Bax/Bcl-2比值增加。Caspase-8、Bid、Caspase-9和Caspase-3蛋白的表达量降低,cleaved-Caspase-8、cleaved-Caspase-9、cleaved-Caspase-3蛋白的表达量升高。
ROS生成可激活c-Jun N末端激酶,进而影响Bcl-2家族蛋白的表达,在线粒体依赖性凋亡途径中发挥关键作用[14-15]。本文结果发现松萝酸显著增加T24细胞内ROS的生成,由此推断ROS水平的升高引起了线粒体途径凋亡的发生。
4. 结论
本研究发现松萝酸以时间和剂量依赖性地抑制人膀胱癌T24细胞增殖:一方面,通过产生ROS,使促凋亡蛋白Bax的表达量增高、抗凋亡蛋白Bcl-2的表达量下降,且Bax/Bcl-2比值增加,引发cleaved-Caspase-9、cleaved-Caspase-3蛋白的表达量升高,通过激活线粒体途径来诱导T24细胞发生凋亡;另一方面,引发cleaved-Caspase-8蛋白的表达量升高、Bid蛋白的表达量降低,通过死亡受体途径来诱导T24细胞发生凋亡。
本文研究了在地衣中丰富存在的次生代谢物松萝酸,首次发现松萝酸可抑制人膀胱癌细胞株T24增殖并诱导其凋亡,为松萝酸作为抗癌药物的开发以及膀胱癌的治疗提供必要的数据。
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表 1 松萝酸对2株肿瘤细胞的抑制率
Table 1 The inhibitory rates of two human bladder cancer cell lines treated with usnic acid
% 组别 24 h 48 h T24 RT4 T24 RT4 空白对照组 0 0 0 0 阳性对照组 14.90±0.45** 24.96±3.84** 23.89±3.53** 34.83±4.36** 12.5 μmol/L UA 3.60±1.23* 2.59±0.37 1.53±0.34 3.65±0.54 25 μmol/L UA 5.82±0.76* 4.78±1.34* 10.42±3.69* 5.93±1.03 50 μmol/L UA 13.16±3.82** 16.95±4.37* 24.37±2.65** 20.45±0.84* 100 μmol/L UA 42.93±0.98** 35.56±2.46** 48.35±3.43** 41.72±1.13** 200 μmol/L UA 58.39±1.57** 39.13±2.35** 62.32±1.44** 55.34±2.40** 注:与空白对照组相比,*表示P < 0.05,* *表示P < 0.01。 -
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